雜草的競(jìng)爭(zhēng)造成的產(chǎn)量損失限制了水稻（Oryza sativa L.）的生產(chǎn)。施用化學(xué)除草劑是目前水稻生產(chǎn)中控制雜草的有效方法，特別是在現(xiàn)代簡(jiǎn)化栽培系統(tǒng)的背景下。然而，長(zhǎng)期大量使用除草劑，如5-烯醇丙酮酰亞胺-3-磷酸合成酶（EPSPS）、乙酰乳酸合成酶（ALS）和乙酰-CoA羧化酶（ACCase）的抑制劑，導(dǎo)致了抗除草劑雜草品種的出現(xiàn)，以及土壤中除草劑的高度殘留，這限制了作物輪作。因此，水稻生產(chǎn)上迫切需要可替代的除草劑和培育相應(yīng)抗除草劑的抗性水稻品種。

2009年以來(lái)，HPPD抑制劑類除草劑市場(chǎng)幾乎逐年增長(zhǎng)，成為除草劑市場(chǎng)增長(zhǎng)很快的產(chǎn)品類型之一。HPPD抑制劑類除草劑全稱是對(duì)羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（HPPD）抑制劑，它們通過(guò)抑制HPPD的活性，使對(duì)羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸的過(guò)程受阻，導(dǎo)致生育酚及質(zhì)體醌無(wú)法正常合成，進(jìn)而影響靶標(biāo)體內(nèi)類胡蘿卜素的生物合成，促使植物分生、新生組織產(chǎn)生白化癥狀，最終導(dǎo)致雜草植株死亡。大多HPPD類型的除草劑結(jié)構(gòu)上并不完全相關(guān)，但是作用效果相同。與其他除草劑相比，HPPD抑制劑的優(yōu)勢(shì)在于其廣譜性、高效力、低毒性、高的作物安全性和良好的環(huán)境兼容性。因此，HPPD抑制劑是公認(rèn)的具有優(yōu)異潛力的水稻除草劑，硝磺草酮（MST）是HPPD抑制劑類除草劑中很重要的產(chǎn)品之一，常用于玉米田防治闊葉雜草和部分禾本科雜草。

近日，江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的研究團(tuán)隊(duì)在《Plant Communications》在線發(fā)表了題為“CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3’-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice”的研究論文，介紹了研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a基因編輯系統(tǒng)對(duì)水稻HPPD抑制劑抗性基因OsHPPD的3’-UTR進(jìn)行基因編輯，創(chuàng)造了水稻HPPD抑制性除草劑抗性新種質(zhì)材料，且沒有產(chǎn)生其他農(nóng)藝性狀的不利影響。

基因編輯已成為快速改進(jìn)作物的有力工具，水稻的多個(gè)農(nóng)藝性狀基因已被成功編輯?；蚓庉嫅?yīng)用多是針對(duì)基因編碼序列（CDS）或特定基因的啟動(dòng)子區(qū)域。然而，一些基因由于其特殊的功能，其CDS和啟動(dòng)子區(qū)域不能被編輯。相比之下，3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）是一個(gè)非編碼的mRNA片段，參與基于mRNA的調(diào)控過(guò)程，包括mRNA的定位、穩(wěn)定和翻譯。此外，3′-UTRs還能調(diào)控許多蛋白質(zhì)的特性，包括蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成、轉(zhuǎn)錄后修飾和蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。因此，3′-UTRs對(duì)高等生物的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程至關(guān)重要，是潛在的基因編輯區(qū)域，可應(yīng)用來(lái)創(chuàng)制新的水稻種質(zhì)。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究團(tuán)隊(duì)嘗試用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)編輯OsHPPD基因的3'-UTR，創(chuàng)造HPPD抑制劑類除草劑抗性的水稻材料。在水稻中，OsHPPD（LOC_Os02g07160）包含一個(gè)265bp片段長(zhǎng)度的3′-UTR（圖1A）。為了評(píng)估OsHPPD基因3′-UTR中的哪些突變可能引起MST抗性，研究團(tuán)隊(duì)使用在線工具（http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR/CRISPR）在265bp的3′-UTR內(nèi)選擇了10個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)（TS1-TS10）進(jìn)行編輯（圖1B）。研究團(tuán)隊(duì)將得到的10個(gè)單向?qū)NAs（sgRNAs）分別克隆到CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a載體，然后將這些載體通過(guò)農(nóng)桿菌導(dǎo)入粳稻栽培品種Yanggeng3012（YG3012）中，該品種適合種植在中國(guó)江蘇省。最終，研究團(tuán)隊(duì)獲得了135個(gè)靶位點(diǎn)突變的T₂個(gè)體（來(lái)源于97個(gè)T₀轉(zhuǎn)化體）（圖1C）。

圖1A-C OsHPPD基因示意圖及其3′-UTR的編輯位點(diǎn)和編輯事件

研究團(tuán)隊(duì)使用硝磺草酮（MST）來(lái)測(cè)試T₂個(gè)體的除草劑抗性。為了確定田間條件下合適的MST劑量，研究團(tuán)隊(duì)在施用11種不同劑量的MST后，對(duì)10個(gè)秈稻品種和10個(gè)粳稻品種的存活率進(jìn)行了測(cè)量。結(jié)果顯示，秈稻品種對(duì)MST的敏感性高于粳稻品種。在施用45 g ai ha^-1 濃度的MST后，秈稻品種和粳稻品種的平均存活率分別為50.5%和84.25%。提高M(jìn)ST的濃度會(huì)導(dǎo)致植株成活率顯著下降。在施用120 g ai ha^-1濃度MST后，粳稻品種和秈稻品種的平均存活率分別為2.95%和3.5%（圖1D）。因此，研究團(tuán)隊(duì)最終選用120 g ai ha^-1濃度的MST來(lái)評(píng)估所有135個(gè)T₂突變體品系在田間條件下的除草劑抗性。經(jīng)過(guò)14天的處理，只有兩個(gè)品系（TS8-2^#和TS8-8^#）能夠存活，而其他133個(gè)T2品系和野生型材料均已死亡（圖1E）。

圖1D&E施用階梯濃度MST后不同粳稻和秈稻品種的存活率

通過(guò)一代測(cè)序，研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了TS8-2^#和TS8-8^#中sgRNA靶位點(diǎn)確實(shí)發(fā)生了編輯突變。值得注意的是，這兩個(gè)抗性品系是在同一個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生了突變。其中，TS8-2^#是純合子，在2304位置有一個(gè)1bp的缺失，而TS8-8^#是雜合子（WT/+1），在第2304位有1bp的插入（圖1F）。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)PCR測(cè)序最終選擇了兩個(gè)無(wú)轉(zhuǎn)基因的純合子編輯系（TS8-2^#-10和82TS8-8^#-6）用于后續(xù)分析（圖1G、H）。

圖1F-H TS8-2^#和TS8-8^#中sgRNA靶位點(diǎn)編輯突變情況

為了進(jìn)一步研究TS8-2^#-10和TS8-8^#-6的抗性水平，研究團(tuán)隊(duì)在溫室條件下測(cè)試TS8-2^#-10、TS8-8^#-6以及野生型對(duì)不同MST劑量的反應(yīng)。MST劑量梯度為0、0.125×、0.25×、0.5×、1×、2×、4×和8×，其中1×代表120 g ai ha^-1。在施用480g ai ha^-1濃度的MST后，野生型植株全部死亡，而TS8-2^#-10和TS8-8^#-6植株則存活下來(lái)，并達(dá)到未處理對(duì)照植株鮮重的44.2%和29.8%（圖1I）。據(jù)此，研究團(tuán)隊(duì)繪制了植株鮮重的MST劑量反應(yīng)曲線，作為計(jì)算MST GR50值（使生長(zhǎng)減少50%的除草劑劑量）的函數(shù)曲線（圖1J）。野生型的GR50值為71.14±6.12 g ai ha^-1，比TS8-2^#-10（338.63±26.33 g ai ha^-1）和TS8-8^#-6（263.87±19.34 g ai ha^-1)的GR50值低得多。基于抗性指數(shù)（RI）的計(jì)算值，基因編輯品系TS8-2^#-10和TS8-8^#-6對(duì)HPPD抑制性除草劑表現(xiàn)出的抗性水平分別是野生型抗性的4.8倍和3.7倍。

圖1I&J TS8-2^#-10、TS8-8^#-6以及野生型對(duì)不同MST劑量的反應(yīng)

為了確定兩個(gè)抗MST除草劑基因編輯品系是否對(duì)其他農(nóng)藝性狀產(chǎn)生不利影響，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)未施用MST除草劑的田間條件下的植株農(nóng)藝性狀進(jìn)行了測(cè)定。

結(jié)果顯示，MST抗性株系TS8-2^#-10和TS8-8^#-6與野生型株系之間沒有明顯的表型差異（圖1K）。這表明編輯水稻OsHPPD基因3′-UTR特定位點(diǎn)可以增加MST抗性，但不影響其他農(nóng)藝性狀。

圖1K TS8-2^#-10、TS8-8^#-6與野生型的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

綜上所示，本研究通過(guò)對(duì)水稻OsHPPD基因3'-UTR進(jìn)行位點(diǎn)基因編輯，創(chuàng)造了水稻HPPD抑制性除草劑抗性新種質(zhì)材料，且沒有產(chǎn)生其他農(nóng)藝性狀的不利影響。此外，本研究強(qiáng)調(diào)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的優(yōu)良基因3'-UTR基因編輯，可以促進(jìn)植物重要農(nóng)藝性狀的改良。

—— 參考文獻(xiàn) ——

Wu Y, Xiao N, Cai Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated editing of OsHPPD 3'-UTR confers enhanced resistance to HPPD-inhibiting herbicide in rice[J]. Plant Communications, 2023, 100605.

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