Ampha Z32花粉活力分析儀的應(yīng)用：評估大麻花粉的活性和數(shù)量
日期：2022-04-20 18:13:36
大麻（ Cannabis sativa L.），大麻科大麻屬，一年生草本植物，廣泛種植于亞洲、歐洲及南美等國家和地區(qū)，是我國傳統(tǒng)的纖維作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值，被廣泛應(yīng)用于紡織、食品、造紙和建筑等多個(gè)領(lǐng)域。因大麻中的四氫大麻酚（THC）具有致幻成癮的特性，故根據(jù)其含量不同而被區(qū)分為工業(yè)大麻（中國THC＜0.3%，歐盟＜0.2%，美國＜0.5%）和毒品大麻。大麻素是大麻中特有的含有烷基和單萜基團(tuán)分子結(jié)構(gòu)的一類次生代謝產(chǎn)物，最主要2種成分是四氫大麻酚( THC) 和大麻二酚( CBD) 。大麻二酚( CBD) 是非精神活性化合物，可以拮抗 THC 與受體的結(jié)合，消除 THC 對人體產(chǎn)生的致幻作用，除此之外 CBD 具有抗炎、殺菌、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗氧化等作用，同時(shí)還具有治療精神分裂和阿爾茲海默癥等病癥的潛在醫(yī)療價(jià)值，隨著對其藥理作用的挖掘，選育高CBD含量低THC水平的藥用大麻品種以已成為全球性的熱點(diǎn)研究。但由于工業(yè)大麻為多為雌雄異株植物，主要是由雌株合成植物大麻素、萜烯和其他次生代謝物，雄株產(chǎn)生花粉，通常大麻素濃度很低，因此藥用大麻的全雌系選育或誘雄制種對于雌株性狀的保存具有極大的意義，也是目前面臨的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。全雌系誘雄過程中，鑒定花粉的活力和數(shù)量（代表雄配子體的適應(yīng)性）對于成功授粉至關(guān)重要。德國霍恩海姆大學(xué)的研究者在本次研究中利用Ampha Z32花粉活力分析儀（阻抗流式細(xì)胞儀，IFC）：● 評估了兩種富含植物大麻素的大麻基因型KANADA（KAN）和A4的花粉活力（PV）和花粉數(shù)量（TPC）；● 研究了硫代硫酸銀溶液（STS）和赤霉素溶液（GA3）誘導(dǎo)對兩種大麻基因型PV和TPC的影響；● 研究開花天數(shù)（DAF）對基因型內(nèi)和基因型間PV和TPC的影響。結(jié)果表明，IFC法可準(zhǔn)確測量大麻的花粉活力并有效估算花粉數(shù)量，是一種高效、可靠、無標(biāo)記的測量方法，可進(jìn)一步協(xié)助藥用大麻的育種策略，為大麻植物育種和種植生產(chǎn)開辟新的機(jī)會。
Ampha Z32花粉活力分析儀（瑞士Amphasys AG）信號的采集和轉(zhuǎn)導(dǎo)A）細(xì)胞在不同頻率的交流電場中的檢測結(jié)果，低頻下反映細(xì)胞的體積特性，高頻下反映細(xì)胞膜的介電特性即細(xì)胞活性；B) 微流控芯片；C）流經(jīng)交流電場的細(xì)胞的阻抗信號（藍(lán)色實(shí)部即電阻信號，綠色虛部即容性電抗信號），細(xì)胞膜完整性決定容性電抗的大小，故可通過虛部信號來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，最終以阻抗相位角-振幅散點(diǎn)圖反映出來Ampha Z32花粉活力分析儀細(xì)胞儀（瑞士Amphasys AG），通過檢測流經(jīng)交流電場的細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞的電阻抗信號，分析獲得細(xì)胞的數(shù)量、大小、活性。該儀器可以在0.3-30MHz的范圍內(nèi)同時(shí)測量4個(gè)不同頻率下細(xì)胞的電阻抗特性，適配微流控芯片通道尺寸范圍為15-400μm，可滿足0-300μm范圍內(nèi)的任意生物、非生物單細(xì)胞的活性測量。已有研究報(bào)道，硫代硫酸銀溶液（STS）和赤霉素溶液（GA3）可通過與乙烯激素競爭誘導(dǎo)全雌系植株雄花形成并開花，本實(shí)驗(yàn)研究了KAN和A4兩種基因型大麻經(jīng)這兩種誘雄激素誘導(dǎo)開花后的第11、14、18、21和24天（DAF）所收獲的雄花數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有經(jīng)GA3和STS溶液處理的植株都產(chǎn)生了雄花，且植株雄花數(shù)量均隨時(shí)間推移而增加，這表明誘雄激素和開花天數(shù)的交互作用對雄花數(shù)量有顯著影響（表1）。相較于DAF前期，DAF后期雄花數(shù)量的增加更為顯著，其中GA3處理的植株在24DAF的單株雄花數(shù)最高，為220.60；STS處理的植株在24DAF的單株雄花數(shù)最高為273.33（圖1a）。
圖1 在開花第11、14、18、21天（DAF）收獲的雄花數(shù)a）赤霉素（GA3）和硫代硫酸銀溶液（STS）處理；b）兩種基因型KAN和A4。此外，基因型和DAF的交互作用同樣顯著影響植株雄花數(shù)量（表1），即基因型KAN和基因型A4的雄花數(shù)量均隨采樣時(shí)間的推移而增加，其中基因型KAN在24DAF產(chǎn)生的雄數(shù)量最高，為189.74；基因型A4在11、21、24DAF的雄花數(shù)量顯著高于基因型KAN，且在24DAF的雄花數(shù)量最多，達(dá)到317.78（圖1b）。表1 每株雄花數(shù)、花粉細(xì)胞總數(shù)（TPC）和花粉活力（PV）的性狀方差分析表
不同誘雄激素下，不同開花天數(shù)的花粉細(xì)胞總數(shù)（TPC）如圖2所示，GA3誘導(dǎo)下植株的平均TPC僅為850-1500，而STS誘導(dǎo)下植株的平均TPC在8-14DAF呈上升趨勢，并在14DAF達(dá)到最高（1.54×105），隨后逐漸下降，在24DAF時(shí)最低（6.67×104），總體而言，STS所誘導(dǎo)植株產(chǎn)生的TPC大約是GA3誘導(dǎo)下的100倍，可見兩種誘雄激素下的平均TPC存在顯著差異，但兩個(gè)基因型間的平均TPC并未發(fā)現(xiàn)顯著差異（表1）。
圖2 赤霉素（GA3）和硫代硫酸銀（STS）誘導(dǎo)開花后的不同天數(shù)產(chǎn)生的平均花粉細(xì)胞總數(shù)（TPC）花粉數(shù)量可能是提高雜交種子產(chǎn)量的關(guān)鍵性狀之一，但在以往確定雌株大麻誘雄效率的研究中，卻并未考慮花粉數(shù)量。在本次研究的采樣期間內(nèi)，兩種誘雄激素處理下的兩種基因型的雄花數(shù)量差異均不顯著，但TPC差異顯著，STS處理產(chǎn)生的花粉細(xì)胞數(shù)量明顯高于GA3。因此在大麻育種過程中，通過STS可誘導(dǎo)雄花并產(chǎn)生足夠數(shù)量的花粉供授粉，可有效減少雄株的種植比例，且從花粉數(shù)量推斷14-18DAF可能是理想的采粉窗口期。不同誘雄激素下，不同開花天數(shù)的花粉活力（PV）如表1所示，基因型、誘雄激素類型以及開花天數(shù)（DAF）的交互作用顯著影響花粉活性（PV）。相較于STS處理，兩種基因型在GA3處理下的PV在所有DAF內(nèi)都較低，但差異大小各不相同。STS處理下，基因型A4在18DAF的PV最大（79.36%），但與14 (77.88%)、21 (71.33%) 和 24 (51.92%) DAF的PV無顯著差異，8(45.66%)和11(53.86%)DFA的PV較低（圖3a）；而基因型KAN在11DAF的PV最大（78.18%），與8 (71.23%)、14 (77.22%)、18 (67.20%) 和 21 (70.43%) DAF的PV沒有顯著差異，但24 (36.49%)DAF的PV明顯下降。GA3處理下，基因型A4的PV在11（34.90%）DAF最高，24 (14.88%) DAF最低；而基因型KAN的PV在14（24.24%）DAF最高，8DAF最低，僅為0.63%（圖3b）。
圖3 基因型（a）A4和（b）KAN在GA3和STS處理下的花粉活性力（%）花粉活力對溫度和濕度極其敏感，IFC法可在收獲花粉后立即測量花粉活力，避免長時(shí)間暴露于環(huán)境壓力所導(dǎo)致的花粉活力受損，可有效指導(dǎo)花粉收獲的最佳時(shí)間。本次研究結(jié)果表明，8-24DAF為大麻花粉收獲的窗口期，利用這17天的窗口期靈活調(diào)整雌花開花的同步性，可有效提高大麻育種中的授粉成功率。
